發布時間：2023-05-31 15:00:08
序言：寫作是分享個人見解和探索未知領域的橋梁，我們為您精選了8篇的干細胞培養技術樣本，期待這些樣本能夠為您提供豐富的參考和啟發，請盡情閱讀。
述。
1胞外生物支架材料的應用
研究者對各種胞外支架材料進行了研究，包括聚乙烯樹脂、海藻酸鹽、聚氨酯泡沫等，都是具有親水多孔性結構的天然或人工合成的有機大分子。在一定的培養條件下，肝細胞在基質孔隙中重組形成許多有功能的聚集體，這些聚集體中可能具有接近的細胞-細胞接觸，且形成類似于體內組織的結構，因而表現出比早先單層貼壁培養的肝細胞更好的生理功能。
1.1海藻酸鹽(alginate)海藻酸鹽是目前常用的促進肝細胞聚集的物質，藻酸鹽海綿體具有高度多孔的結構，孔徑在100～150 μm，由于藻酸鹽是親水性物質，所以肝細胞能容易地進入基質內部。Glicklis［1］等以藻酸鹽海綿體為支持基質培養肝細胞。DNA測定表明最初兩周肝細胞的數量并不增加，MTT測定顯示絕大多數細胞保持活力。接種24 h內在藻酸鹽海綿狀結構內觀察到活細胞聚集體，這種聚集體在培養的第四天平均直徑100 μm，與基質孔徑同一數量級。聚集體的三維結構促進了細胞功能的表達：1周內達最大白蛋白分泌量。微囊化肝細胞培養利用半透膜將肝細胞包在囊內(囊壁分子量截率
1.2聚氨酯泡沫(Polyurethane foam，PUF)聚氨酯泡沫是另一種高度多孔性的過濾材料。日本Gion等［3］以PUF為材料設計出一種填充床式生物反應器，以該反應器為基礎組成的混合型生物型人工肝（Bioartificial Liver，BAL），在狗肝衰竭模型中，可顯著降低血氨和血清肌酐，升高血糖和血壓。Pahernik等［4］研究了以PUF材料進行豬肝細胞高密度培養的可行性，作者認為PUF是一種生物相容性較好的材料，適于肝細胞的高密度培養。Kurosawa等［5］采用聚氨酯膜(Polyurethane membrane，PΜM)作為肝細胞培養支持物，構建固定床(fixedbed)生物反應器并用于大鼠肝細胞的高密度培養。PΜM孔徑從上層到下層逐漸遞減，肝細胞懸液流經PΜM時，5 min內黏附的肝細胞密度可達2～3×107/cm3PΜM，黏附效率高達99%；黏附肝細胞以輕度聚集的球形體形式存在，白蛋白分泌持續時間比單層培養長。
1.3微載體(microcarrier)微載體目前經常用于生物型人工肝的肝細胞培養，可以大大提高生物反應器內肝細胞的培養密度。微載體細胞培養技術可以形成以微載體為核心的肝細胞聚合球，細胞濃度可達107 cell/ml，使肝細胞不貼壁而呈懸浮狀培養，更接近于正常的生理狀態。Wermer等［6］用不同密度的永生化人肝細胞與不同濃度的明膠微載體進行旋轉培養7 d后，2×105 cell/ml與1 g/L微載體組獲得的細胞濃度為4.5×106 cell /ml；5×105 cell/ml與3 g/L微載體組細胞濃度為7.1×106 cell/ml。微載體上沾滿細胞，呈球形狀態。肝細胞24 h可產生5 ng/ml乙基甘油二甲基苯胺(EMGX)，而用50 ng/ml苯巴比妥誘導3 d后，則產生26 ng/ml的MEGX，顯示了肝細胞代謝的潛能。目前，微載體培養是動物細胞大規模高密度培養中技術相對完善及有實用價值的一種培養模式，并且已有多種商品化的微載體可供選擇。
1.4中空纖維(hollow fiber)中空纖維是人工合成的高分子材料半透膜，纖維內腔直徑約200 μm。將數百或數千束纖維裝在容器中，即中空纖維艙，最常用于構建生物型人工肝生物反應器。Liu等［7］對體外中空纖維肝輔助裝置中的永生化豬肝細胞進行了研究，發現細胞接種后增殖迅速，在培養的25 d期間，肝細胞保持著對安定及撲熱息痛的代謝活性。超微結構檢查可見形成膽小管結構的橋粒及連接復合體。Sosef［8］等將豬的自體肝細胞置于中空纖維倉，培養24 h后治療豬急性肝功能衰竭（FHF）模型，明顯延長存活時間，降低血氨水平。在多種材料結合的基礎上，研究者提出并嘗試了多種有應用價值的肝細胞培養系統。Arnaout［9］等在中空纖維外腔植入微載體培養的肝細胞構建生物型人工肝，對FHF和慢性先天性代謝性肝病動物模型均有肝輔助作用。Nyberg［10］等在中空纖維內腔內種植膠原凝膠包埋肝細胞，培養液在膠原外纖維內循環，形成肝細胞培養的三維框架，患者血漿在纖維外灌流，體外實驗證明此系統具有合成蛋白功能及藥物代謝功能，動物實驗能改善FHF動物模型肝功能指標，但未見進一步的臨床應用報道。Dixit［11］將兩種不同的中空纖維管置于同一外殼內，其中一種通過培養液，纖維外部附肝細胞; 另一纖維管循環宿主血液/血漿。體外實驗研究表明這種肝細胞反應器可提供特異性的肝細胞功能。Gerlach［12］等將細胞培養于三維網狀交叉的中空纖維之間，實驗表明可使肝細胞高密度培養，肝細胞功能維持可達5周。Funatu K［13］等用聚氨酯泡沫(polgurethanefoam，PUF)在離心條件下中空纖維內培養肝細胞，3 d內形成表面光滑的柱型組織化結構(Organoid)，維持肝功能達4個月以上，Nakazawa［14］應用此種生物反應器治療FHF豬動物模型可改善其生化指標，提高生存率。
1.5其他Tobe S［15］等報道大鼠的肝細胞能夠附著著在一種缺乏唾液酸蛋白的聚DP芐乙烯D乳酰氨(polyNpvinylbenzylDlactonamide，PVLA)上形成錨定的多層聚集體，在培養液中加入EGF和胰島素時形成穩定的三維結構。這種聚集體中的肝細胞有很高的白蛋白分泌能力，作者推測可能是多層聚集體中的細胞通過聚集體的形成而穩定地分化所致。Ohshima等［16］將聚乙烯樹脂(Polyvinyl formal，PVF)置于一圓柱形容器內組成一種填充床式生物反應裝置，適于肝細胞的培養密度可達107 cell/cm3，且培養肝細胞具有良好的氨代謝、尿素合成及分泌白蛋白等功能；掃描電鏡觀察顯示，肝細胞在形態及排列等方面均優于單層培養。
2模擬微重力培養
模擬微重力肝細胞培養是利用旋轉式生物反應器，提供一個模擬微重力的條件，反應器內培養的細胞呈一種失重狀態，可自發形成組織樣結構。研究者們在一系列的細胞三維培養研究中先后取得重要進展表明，利用回轉生物反應器(Rotating Wall Vessel Bioreactor，RWVB)模擬微重力培養環境，可以顯著改善離體細胞的生長狀況，使在普通培養條件下只能二維貼壁生長的動物細胞表現出三維增殖與分化。Rise k等［17］等利用模擬微重力培養環境共培養純化的肝細胞與膽管上皮細胞，發現肝細胞與膽管上皮細胞自發聚集于聚合物支架上，生長達2個月，在三維結構上肝組織內有肝索、膽管以及管狀內皮結構形成。國內張鈺鵬［17］也在模擬微重力條件下進行大鼠原代肝細胞微載體培養，多個微載體表面的肝細胞可連接成團，形成“肝細胞微載體聚球體”的基本結構模式。透射電鏡下，肝細胞在不同部位顯現不同的膜結構：與培養液接觸的表面出現許多不規整的微絨毛，類似體內的肝竇面。肝細胞之間則胞膜平直，膜間縫隙狹窄，類似體內的肝細胞間接觸面。
3展望
【關鍵詞】三維細胞培養；流感病毒；監測
【中圖分類號】R372 【文獻標識碼】A 【文章編號】1004―7484（2013）09―0118―01
2009年5月，新甲型H1N1病毒造成世界范圍內的大流行，2013年春季在中國長三角地區流行甲型H7N9流感病毒，加強對流感病毒監測對于疫情分析、流行趨勢研判、疫苗研制等方面有著極其重要的意義。目前國內在流感病毒監測方面主要采用核酸檢測和單層貼壁細胞培養技術。由于標本采集的問題及細胞在體外環境下生長逐漸喪失了原有的性狀[1]，在很多情況下，所取到的研究結果和實際結果不符合。傳統單層細胞培養得率過低是大量病毒監測工作中難以突破的的瓶頸。我們建立了三維細胞培養技術方法在流感病毒的網絡監測中得到較好的應用。
1 材料與方法
1.1 樣本采集：上海市黃浦區流感網絡監測定點醫院（第二人民醫院）流感監測點于2013年1-2月冬春季采集的類流感病例鼻咽拭子合計76份。
1.2 核酸抽提：取鼻咽拭子病毒采樣液140微升，使用QIACUBE?核酸抽提儀，試劑使用QIAamp? Viral RNA Mini Kit（250）試劑盒提取病毒RNA。
1.3 流感病毒核酸檢測：Real-Time RT- PCR檢測使用上海之江生物技術有限公司甲型流感病毒核酸檢測試劑盒（A型/B型流感核酸檢測試劑盒、H1、H3、H1N1（2009pdm）型核酸檢測試劑盒），PCR擴增儀使用國產上海宏石SLAN熒光定量PCR擴增儀。反應條件如下：45 ℃ 10 min逆轉錄，95 ℃ 15 min變性，95 ℃ 15s，60℃ 1min FAM通道檢測熒光，40個循環。
1.4三維細胞培養
1.4.1培養儀：采用Hamilton?公司的BioLevitator?三維細胞培養儀。
1.4.2細胞來源：75mL細胞培養瓶復蘇的狗腎細胞（MDCK），消化后得到懸浮細胞。將懸浮細胞接種到GEM微載體上，在培養設備上運行接種程序。當細胞生長覆蓋率達到80%以上時，加入兩倍量的新的GEM微載體。繼續培養，在培養過程中根據需要更換新的培養基。當細胞生長覆蓋率達到80%以上時，將培養管內溶液分裝到三個新的培養管中。向三管中分別加入兩倍于原體積的新培養基和兩倍于原數量的GEM微載體。在培養設備上運行接種程序。
1.4.3細胞生長：當細胞生長覆蓋率達到80%以上時，取出培養管，用磁鐵吸住GEM微載體，移去培養基。用3-Dissolution試劑將GEM微載體溶解，用磁鐵吸去磁性顆粒，得到細胞。轉移細胞溶液至新的50mL管中，將細胞清洗、懸浮后細胞分裝并計數。細胞樣品可以用于下游的檢測或其它應用。
1.4.4接種病毒
1.4.4.1接種中毒：當細胞生長覆蓋率達到要求后，開始進行病毒感染實驗。采用上述9份季節性流感病毒H3核酸檢測陽性標本分A、B組進行染毒試驗。A組為貼壁細胞培養的細胞，B組為三維細胞培養的細胞。置37?C， 7.5% CO2濃度培養，每天觀察，當有90%的細胞出現CPE后，進行收毒。
1.4.4.2收毒后的病毒液可以用移液管吸入離心管，在1，000-2，000轉下離心10mins，以此除去細胞碎片，將離心后的上清夜轉移，棄底部沉淀，該上清液進行病毒滴度測定。
1.4.5 三維細胞培養細胞的觀察與計數
1.4.5.1取50μL培養液（cells on GEM?）至96孔板中的一個孔內。加入100μL Hoechst 33342溶液到該孔內。室溫下放置15-20分鐘。用顯微鏡在紫外和DAPI濾光片下觀察。
1.4.5.2細胞計數用CubeMagnet將剩余的400μL細胞樣品中的生長在GEM上的細胞吸附到底部。用移液器將培養基移除。加入1mL PBS到樣品中。在CubeMagnet幫助下，移除PBS緩沖液。加入200μL 3-Dissolution到樣品中。37?C孵育10-15分鐘，用顯微鏡觀察直到GEM被完全溶解。將蓋玻片平鋪在血細胞計數器上。加入50μL Trypan Blue和50μL細胞樣品到微離心管中。蓋上蓋子混勻。取10μL細胞/Trypan Blue混合物到蓋玻片下面。用血細胞計數器對活/死細胞進行計數。
1.5 MDCK單層細胞培養：參照中國國家流感中心實驗室流感病毒監測方案操作方法。[2]
1.6 血凝試驗方法：參照中國國家流感中心實驗室流感病毒監測方案操作方法。[2]
1.7 結果的統計與分析使用統計學軟件stata 7.0。
2 結果
2.1 標本直接核酸檢測結果：經RT-PCR篩查甲型流感核酸陽性標本9份，陽性率為11.8%（9/76）。其中H3分型陽性6例，未分型（包含H1、H3、H1N1（2009pdm））共3例。CT值分別為29.2，31.2，32.1，33.2，35.2，37.5 。
2.2細胞生長效率比較：75mL細胞瓶狗腎細胞（MDCK）工作容量為10mL，細胞總數為2*106個。傳統貼壁細胞培養傳代一次可以得到9瓶25mL細胞瓶的狗腎細胞用于病毒培養，其工作容量約為18毫升單位細胞數2.5*105個/mL，得到的細胞總數約為4.5*106個。利用三維細胞培養技術計數培養后可以得到4瓶40mL細胞懸液。用細胞計數板5次，結果見表一。 計算公式：總細胞數=單格細胞計數*104*160/ml。
2.3 接種中毒后血凝效價比較：用9份甲型流感病毒病毒核酸陽性標本，采樣液染毒后血凝效價測定結果見表二，A組為單層細胞貼壁培養中毒，B組為三維細胞培養后中毒實驗。
以上結果用幾何均數配對T檢驗統計分析，結果P > |t| = 0.5943，顯示三維培養傳代細胞的染毒實驗滴度與貼壁細胞培養的細胞中毒后血凝試驗效價結果無顯著性差異。
2.4 甲型流感病毒細胞培養后核酸檢測結果比較：將9例經直接檢測甲型流感核酸陽性標本分別接種三維培養和貼壁培養的MDCK細胞，CO2培養，觀察中毒后，重新抽核酸進行核酸分型檢測，均為H3型季節性流感。結果見表三。A組為單層細胞貼壁培養中毒液檢測，B組為三維細胞培養后中毒液檢測。
以上結果用配對T檢驗統計分析，結果P > |t| = 0.3956，貼壁細胞培養和三維細胞培養結果無顯著性差異；細胞培養后病毒大量增殖，使得核酸分型檢測結果更明確。
3 討論
流感病毒的監測包括核酸檢測和細胞培養兩方面。細胞培養是對流感病毒對細胞的敏感性，抗原性分析的必須方法，也可以通過細胞中毒實驗使得某些直接核酸檢測結果不明確的標本得以明確病毒核酸的分類，通過較少病毒載量的標本在細胞中增殖也是對一些不明分類的流感病毒深入研究的基礎。
三維細胞培養技術在細胞培養上更貼近于自然狀態，細胞生物活性較高。[3]利用該技術得到細胞對已病毒培養更為高效。三維細胞培養技術可以在病毒培養中得到極大的發展。對于三維結構下細胞生物活性較高狀態的細胞染毒實驗可能大大提高流感病毒染毒效果。得益于三維培養技術的革新，使得該技術能夠培養在傳統培養板上難以培養的細胞；細胞生長狀態更加接近于體內狀態，利于細胞的極化與功能化[4]；省去消化、離心等操作，簡化細胞培養流程；可以在短時間內獲得大量細胞；細胞的一致性可以得到保障；微載體透光性好，沒有自發熒光，不必與細胞分離就可以進行后續觀測；細胞培養表面大，可以獲得高密度細胞；微載體材質與結構適合細胞生長，表面提供各種蛋白包被可滿足特殊細胞培養的需求；微載體內嵌磁性顆粒，便于外加磁力進行操控；大大減少耗材用量，降低耗材成本，并且有利于環保；減少研究者在細胞培養上花費的精力。
本次研究中，三維細胞培養方法不僅比普通單層細胞培養有更多的細胞收獲，而且在病毒敏感性，血凝效價實驗等各方面與單層細胞培養方法無顯著性差異。
三維細胞培養技術在流感病毒培養中得以較好的應用，該技術在細胞傳代、細胞復蘇、細胞凍存等細胞技術都已經較為成熟。特別是細胞傳代的應用，細胞培養技術與新材料新方法結合的全新思路解決和突破了傳統貼壁細胞培養技術細胞傳代細胞得率過低的技術瓶頸，對于我們實驗室高通量的流感病毒監測、培養具有十分重要的意義。
參考文獻：
[1] 胡康洪， 姚穎.三維細胞培養技術的研究與應用， 醫學分子生物學雜志， 2008， 5（2）：185-188
[2] 全國流感監測方案（2010版）
[3] ALVIA，STUPACK D G，Cell survival in a three-dimensional matrix[J].Methods Enzymol，2007，426：85-101.
[4] 盛治國， 郭家彬， 彭雙清. 體外細胞三維培養技術在藥理毒理學研究中的應用， 中國藥理學與毒理學雜志， 2007. 21 （5）
誘導多能干細胞只是干細胞的一種，但是，可以繞開使用胚胎干細胞的倫理限制，而且具有豐富的來源，因此被視為再生醫學和器官移植的重要突破。此后，研究人員就希望能用誘導多能干細胞在實驗室中培養和生成各種器官、組織和細胞，用以治療更多疾病。現在，研究人員發現，誘導多能干細胞確實能培養并生成有生理功能的多種器官、組織和細胞。
誘導多能干細胞培育出肝臟
英國《自然》雜志2013年7月3日報道，日本橫濱市立大學谷口英樹研究小組與美國西奈山醫學院研究人員合作，利用人類誘導多能干細胞培育出微小肝芽，然后移植到小鼠體內，結果這些肝芽成功生長成微型人類肝臟或稱“迷你肝臟”，并像健康器官一樣具有正常的肝功能。這是世界上首例用誘導多能干細胞培養的立體肝臟。在此之前，已經有研究小組能夠用誘導多能干細胞培養出肝細胞，但是還不能培養出可以在人體內發揮功能的立體結構肝臟。
日本和美國研究人員利用人類誘導多能干細胞培養的肝臟從嚴格意義上來說還不是肝臟，但是可以看成是微小肝臟，它們的直徑只有4毫米～5毫米，卻表現出了肝臟的生物活性和生理功能。
研制的過程是，將人類皮膚細胞重編程為誘導多能干細胞，并且讓其分化成表達肝臟基因的早期肝細胞。然后在培養基中加入從臍帶血中提取的內皮細胞和制造骨骼、軟骨和脂肪的間充質干細胞，內皮細胞的作用是指揮血管排列和生成。此后，這些細胞在培養基中自行成長為球狀的細胞團，如同人類胚胎中肝臟最初的發育一樣。兩個月后，這些細胞團快速生長成直徑為4毫米～5毫米的微小肝臟，研究人員再把這種微小肝臟移植到小鼠的皮膚下。此后，微小肝臟與小鼠的血管慢慢連接起來，最終發育成類似成體肝臟的器官。這種微小肝臟還接管了小鼠肝臟的一些正常的工作。
為了驗證這種微小肝臟是否有生理功能，研究人員對小鼠注射了兩種藥物，以檢查肝臟是否有代謝藥物的功能。這兩種藥物是抗炎藥酮洛芬和治療高血壓的藥物異哇胍。結果發現，小鼠的血液中產生了通常來自人類肝臟的代謝產物而非小鼠肝臟的代謝產物。這說明移植進小鼠體內的微小肝臟發揮了作用。
同時，研究人員還做了一個對照研究，以檢測微小肝臟是否有解毒功能，以便幫助肝功能衰竭的小鼠存活。實驗用了兩組小鼠，一組小鼠的每一只體內都植入了12個誘導多能干細胞培養的微小肝臟，另一組小鼠作為對照組，未植入微小肝臟。研究人員對兩組小鼠都注射白喉毒素。結果，移植了微小肝臟的一組小鼠有近1/3存活超過了40天，而對照組小鼠在10天內都死亡了。
此外，研究還發現，誘導多能干細胞生成的微小肝臟能夠分泌肝臟的特異性蛋白，也能清除血液中的毒素，并且產生人類特異性代謝物。誘導多能干細胞生成的微小肝臟最為重要的特點是，它很快就能與附近的血管融合，從而獲得受體血液系統的支持。這是器官移植最重要的一步，因為有了受體血液系統的支持，而且不受到受體免疫系統的排斥，移植的器官就會持續生長，成為受體體內的一員。因此，盡管這種能首次連接到受體血液系統的具有復雜生理功能的器官還比較微小，但已經是再生醫學的一個重要里程碑。
當然，未來如果能進一步表明誘導多能干細胞培養的微小肝臟移植進人體后不受人的免疫系統排斥，那么微小肝臟就可以移植給人體，至少可以取代成人30%的正常肝臟功能。這對于挽救肝功能衰竭的患者具有重要的意義。當然，如果誘導多能干細胞培養肝臟的技術進一步成熟和有效，則有可能培養出像成人肝臟那么大的肝臟，器官移植將會獲得突破性進展，因為病人再也不用長時間等待供體器官了。但是，要達到這一步可能還要等上較長時間。
培育簡單器官和組織更容易
由于肝臟具有較為復雜的多種生理功能，如解毒功能、代謝功能、分泌膽汁、免疫防御功能等，這就意味著用干細胞培育肝臟更具挑戰性和復雜性。因此，在用干細胞培育較為簡單的器官方面，應當更有收獲。事實也完全證明了這一點。
現在，多個國家的研究人員已經能用誘導多能干細胞培育多種簡單的器官，如血管、肌肉、毛囊等。
美國麻省總醫院史迪爾腫瘤生物學實驗室主任雷克思·杰恩等人利用人類誘導多能干細胞衍生的血管前體細胞，在小鼠身上培育成了有生理功能的血管，而且這些血管維持活性長達280天。
用人類誘導多能干細胞培育的血管主要可以用于治療心血管病和糖尿病導致的血管損害。比如，糖尿病晚期常導致病人的大血管并發癥，如動脈粥樣硬化、冠狀動脈狹窄（可導致冠心病甚至心肌梗塞）、供應大腦的血管狹窄（可導致腦缺血甚至腦梗塞）、供應下肢的血管狹窄（可導致下肢的疼痛和壞疽），這時就可以用再造血管的方法來治療晚期糖尿病人。同時，還可以用新血管為新生組織提供血液供應。
過去的一些研究顯示，利用人類誘導多能干細胞能生成構建血管所需的內皮細胞，但是，將這些細胞導入到小鼠身上卻無法形成持久的血管。于是，麻省總醫院的研究人員利用來自健康成人以及1型糖尿病病人的人類誘導多能干細胞，在小鼠大腦外表面和皮膚下生成了血管。研究小組采用了一種最初用于人類胚胎干細胞衍生內皮細胞的方法，以此來擴大和培養人類誘導多能干細胞，然后讓這些細胞群生成能夠形成血管的內皮細胞。
隨后，研究人員把這些內皮細胞與間充質前體細胞（可生成必要的結構細胞）一起移植到小鼠大腦的表面。在兩周內，移植細胞形成了血液灌注的血管網絡，它們與鄰近的天然血管一樣發揮了功能，并在小鼠體內持續發揮功能長達9個月。此外，研究人員也用同樣的方法在小鼠皮膚下移植內皮細胞與間充質前體細胞，結果也生成了功能性的血管。但是，在皮膚下的移植需要移植更多的細胞，約為移植到大腦的5倍以上，并且生成的血管的壽命比在大腦生成的血管壽命短。
這項研究還表明，來自健康人的細胞和患1型糖尿病患者的人類誘導多能干細胞衍生的內皮細胞都可以生成能長期維持功能的血管。但是，不同的人類誘導多能干細胞和包括來自同一患者的不同細胞系在生成血管的潛力上有差異，因此，還需要更深入地了解干細胞生成血管的更多機理，而且需要找到更好的方法來操控生成特定器官所需的特異內皮細胞類型。
當然，由人類誘導多能干細胞生成的血管是否能應用于糖尿病病人，還需要在安全性和實用性方面進行更深入的研究，但畢竟這項研究已經讓人們看到了一些希望。
另一方面，用干細胞培養成熟的心肌也有了新的突破。過去，在培養基中培養的心肌細胞并不像人體心肌細胞那樣具有生理功能，例如傳導生物電信號和收縮。為了解決這些問題，美國杜克大學生物醫學工程系的尼納德·伯薩克等人采取了一種新的方法來培育心肌，即用胚胎干細胞來培養心肌。胚胎干細胞不同于誘導多能干細胞，可能會受到倫理制約，而且所能獲得的胚胎干細胞也有限，當然其全能分化和生長的效果優于誘導多能干細胞。
研究人員在實驗室中把人胚胎干細胞分化得到的心肌細胞放入三維水凝膠中。此后，心肌細胞自行組裝成心肌束，形成了纖維細胞在外、內皮細胞穿插其中的三維結構。而且，這種組織并非是心肌細胞的堆積，而是一塊8毫米×8毫米的心肌組織，并且達到了與體內心肌細胞類似的功能指標。通過注入不同的藥物可以檢測心肌電傳導性能的變化和檢測藥物對心肌收縮能力的影響。由此證明，這種由胚胎干細胞培養的心肌組織不僅可以傳導生物電流，而且可以自主搏動。
研究人員認為，這種心肌組織的結構和功能都超過了以前的人工心肌，也是迄今為止和人體組織最接近的人造心肌薄片。雖然這是依靠胚胎干細胞培養的，但是，通過仔細總結培養的機理，未來可以通過提取心臟病人的皮膚細胞以獲取誘導多能干細胞，再由后者來培養特異的心肌組織或心臟，如此，則可以修補病人的壞死心肌，或者直接為病人移植用其自身的皮膚細胞培養的心臟。
培育血細胞
誘導多能干細胞還能培育更多的血細胞，以用于輸血、診斷和治療疾病。
人的血液由血漿和血細胞組成。血漿相當于結締組織的細胞間質，為淺黃色半透明液體，其中除含有大量水分以外，還有無機鹽、纖維蛋白原、白蛋白、球蛋白、酶、激素、各種營養物質、代謝產物等。血細胞則分為紅細胞、白細胞、血小板。人的血細胞總是在不斷地新陳代謝。紅細胞的平均壽命約120天，有粒白細胞和血小板的生存期限一般不超過10天。淋巴細胞的生存期長短不等，從幾個小時到幾年。一般而言，血細胞及血小板來自造血器官，紅細胞、有粒白細胞及血小板由紅骨髓產生，無粒白細胞則由淋巴結和脾臟產生。但是，由于疾病和造血功能異常會導致一些血液方面的疾病，如貧血。
貧血是指人體外周血液中紅細胞容量減少并低于正常范圍下限的一種疾病，但是由于紅細胞容量測定較復雜，臨床上常以血紅蛋白（Hb）濃度來代替。在中國一般把成年男性Hb
因此，貧血的根本原因是紅細胞減少，因而導致血紅蛋白減少，血液攜氧供氧能力下降，這就會對全身造成不同程度的影響。例如，造成神經系統的損害，表現為頭昏、耳鳴、頭痛、失眠、多夢、記憶力減退、注意力不集中等；貧血更影響呼吸循環系統，表現為氣急或呼吸困難，并且有心悸、心律失常和心功能不全；貧血也影響消化系統，因為貧血時消化腺分泌減少甚至腺體萎縮，進而導致消化功能降低、消化不良，出現腹部脹滿、食欲減低、大便規律和性狀的改變等。
長期以來，治療慢性貧血的效果并不如意。研究人員也在尋找新的方法，例如輸血和單獨輸入紅細胞。但是，輸血和輸入紅細胞也可能發生排異反應和輸血反應，甚至染上其他傳染性疾病。如果能用病人的皮膚細胞產生誘導多能干細胞，再由后者生成紅細胞，就可以把紅細胞輸入病人體內，治療貧血。
現在，美國波士頓大學醫學院的喬治·墨菲與波士頓大學公共健康學院的戴維·希爾領導的研究團隊采用一種新的方法，對誘導多能干細胞進行分化，在試管內制造出了大量的人類紅細胞和血小板。這些紅細胞有望用于治療貧血和診斷瘧疾、鐮狀細胞貧血，而血小板則可用來檢查心血管病和治療凝血障礙。
【關鍵詞】 脂肪干細胞； 口腔上皮細胞； 組織工程； 共培養
中圖分類號 R329.2 文獻標識碼 A 文章編號 1674-6805（2013）36-0001-03
各種原因造成的尿道狹窄、尿道缺損是一個難題，近年來，口腔黏膜被認為是用于尿道重建的較為理想的替代物。但口腔黏膜的獲取，也會給患者帶來諸如感覺麻木、開口及活動受限等合并癥。組織工程技術的發展為這一難題的解決帶來了新的希望[1]。組織工程口腔黏膜有望成為尿道重建領域一個理想的修復重建材料[2]。脂肪干細胞（adipose tissue derived stem cell，ADSC）是2001年Zuk等[3]從人脂肪組織中分離培養出的一種多能干細胞，它能夠經由旁分泌方式，分泌多種生長因子，這些生長因子能夠激活上皮細胞，促進上皮缺損的修復[4]。將ADSC引入組織工程口腔黏膜研究，將具備良好的應用前景。本實驗研究體外共培養環境對犬口腔上皮細胞（oral keratinocytes，OK）和ADSC增殖速率、移行速率的影響。
1 材料與方法
1.1 ADSC的獲取和鑒定
取Beagle犬腹部皮下脂肪組織，經Ⅰ型膠原酶（Worthington，美國）消化獲得ADSC，以含10% FBS的DMEM培養液（Gibico，美國）培養，每3天換液一次，細胞融合達90%時，以0.25%胰蛋白酶（Gibico，美國）消化傳代。取P3 ADSC，行流失細胞檢測，檢測細胞表面CD34、CD44、CD45、CD90、CD105和CD106的表達。
1.2 OK的獲取和鑒定
取Beagle犬頰黏膜，經2.0 U/ml的Dispase Ⅱ（Roche Corporation， Germany）消化、0.05%胰蛋白酶（Gibico，美國）消化后，獲得OK，以KSFM培養基培養，細胞融合達到90%時，以0.05%胰蛋白酶消化傳代。取P1 OK，爬片，行免疫熒光檢測細胞AE1/AE3的表達。
1.3 細胞移行速率的檢測
將P3 ADSC和P1 OK種植到同一個刻度培養皿的兩端，每日定時檢測記錄細胞的移行速率，作為對照，刻度培養皿兩端均種植ADSC或OK，記錄細胞移行速率。
1.4 細胞增殖速率的檢測
在ADSC細胞達到50%融合時，每日收集培養液上清，經過濾除菌后，與KSFM培養基1∶1比例混合，形成ADSC條件培養基（ADSC-CM），培養OK細胞，MTT法檢測細胞的增殖速率。在OK細胞達到50%融合時，每日收集培養液上清，經過濾除菌后，與KSFM培養基1∶1比例混合，形成OK條件培養基（OK-CM），培養ADSC細胞，MTT法檢測細胞的增殖速率。同樣檢測正常培養條件下OK、ADSC的增殖速率。
2 結果
2.1 成功獲取ADSC和OK
經酶消化法能夠順利獲得ADSC和OK，ADSC呈紡錘形，少數有突起，為不規則狀（圖1左），細胞相互之間以細絲拉網。流式細胞檢測表明CD90、CD34、CD44、CD105表達呈陽性，CD106、CD45表達呈陰性。OK細胞呈多角形，融合后的細胞呈現典型的“鋪路石”樣外觀（圖1中），細胞形態均一、穩定。免疫熒光見細胞AE1/AE3表達陽性（圖1右）。
2.2 共培養環境下細胞移行速率升高
在單一培養環境下，ADSC移行速率為0.8～5.5 mm/d，共培養環境下ADSC的移行速率增高為0.8～6.8 mm/d。單一培養環境下，OK移行速率為0～1.5 mm/d，共培養環境下OK的移行速率增高為0.2～2.5 mm/d（圖2）。
2.3 共培養環境下細胞增殖速率升高
MTT檢測表明，與常規培養相比，ADSC-CM培養環境下OK細胞的增殖曲線明顯變陡。同樣，OK-CM培養環境下ADSC細胞的增殖曲線也呈變陡趨勢（圖3）。
3 討論
作者：胡健 王強 雷寧玉 任莉 張娟
【摘要】 目的 新鮮人羊膜負載構建兔角膜上皮，為全角膜組織工程作基礎。方法 采用組織塊法培養兔角膜緣干細胞，以新鮮人羊膜為載體，形成單層細胞膜片后用于傳代；采用相差顯微鏡進行形態觀察及AE5、p63免疫熒光鑒定。結果 培養24 h，兔角膜緣組織塊邊緣可見有細胞長出，之后形成“沙灘樣”移形帶，培養至7～8 d細胞在羊膜上形成單層膜狀，細胞透明，邊緣整齊，形態呈多樣化，以卵圓形和多邊形為主；AE5抗體、p63抗體染色陽性細胞比例分別為（41.72±11.35）%、（21.57±6.36）%；2代AE5和p63陽性細胞比例與原代比較，無顯著性差異（P﹥0.05）；3代AE5和p63陽性細胞比例與原代比較，差異有統計學意義（P﹤0.05）；但4代AE5陽性細胞比例又明顯升高。結論 以新鮮羊膜為載體、采用組織塊法培養角膜緣干細胞可獲得較好的角膜上皮片，在傳代細胞中，3代細胞分化程度最低、增殖能力最強，最適合移植。
【關鍵詞】 角膜緣干細胞；新鮮羊膜；細胞培養
【Abstract】 Objective To produce rabbit corneal epithelium with cultivation of rabbit limbal stem cell on human fresh amnion.Methods Rabbit limbal epithelium was cultured on human fresh amnion by tissue block method. It was passage time when the primary cells formed monolayer cell patch. Keratin 3(AE5) and p63 were detected on the primary and four generation cells with immunofluorescence. Contrast phase microscope was used to observe the appearance of cells.Results Cells outgrew from the limbal tissue block within 24 hours， then ‘sandy beach’ band formed， and confluent monolayer cell patch appeared when cultivated 7～8 days. The positive percentage of AE5 and p63 was (41.72±11.35)% and (21.57±6.36)% respectively in primary cells. Positive percentages of AE5 and p63 were no of statistical difference between the second generation cells and primary cells (P﹥0.05)， while there was significant difference between the third generation and primary cells(P﹤0.05)， and AE5 positive cells increased in the fourth generation.Conclusion Corneal epithelium is produced with cultivation of rabbit limbal stem cell by method of tissue block on human fresh amnion. Among all generations， the third generation cells are most suitable to be translated， because of the lowest differential degree and the strongest proliferative ability.
【Key words】 limbal stem cells，fresh amnion，cell culture
組織工程構建角膜上皮是組織工程化全角膜的課題之一。角膜緣干細胞是角膜上皮細胞增殖、分化和移行的來源，目前這一觀點已經得到公認。種子細胞問題解決后，載體的選擇已成為研究重點。本課題組采用新鮮羊膜負載培養角膜緣干細胞，為角膜上皮組織工程的載體選擇提供參考。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 組織來源：兔眼取自健康純系新西蘭大白兔，雌雄不限，體質量2～2.5 kg，由重慶醫科大學動物中心提供，在實驗前用0.25％氯霉素滴眼液點眼，4次/日，共3 d。羊膜取自排除肝炎病毒、AIDS病毒及梅毒等傳染病的剖腹產婦的胎盤。
1.1.2 主要試劑：DMEM/F12培養液、胎牛血清（美國Hyclone公司），鼠抗兔單克隆AE5抗體（K3抗體）、鼠抗兔單克隆抗體p63（英國Abcam公司），免疫熒光染色試劑盒（Sigma公司），硝酸纖維素膜（北京鼎國生物制品公司），青霉素、鏈霉素、慶大霉素（上海生物工程技術服務有限公司）。
1.1.3 主要儀器：相差顯微鏡(Likon UFXⅡ型，OLYMPUS日本)，CO2培養箱(2300型SHELDON美國)，眼科顯微手術器材等。
1.2 方法
1.2.1 新鮮羊膜的制備：①羊膜取材：含抗生素（4 000 U/ml的慶大霉素、青霉素500 U/ml、鏈霉素500 μg/ml）PBS洗去胎盤的血凝塊，鈍性剝離羊膜，使其與絨毛膜分離，同時用含抗生素的PBS沖洗干凈后浸泡20 min，上皮面朝上平鋪于硝酸纖維素膜上。將上述附有羊膜的紙片修剪成2.5 cm×2.5 cm的小塊。PBS沖洗2次，置于細胞培養板中DMEM/F12培養液（含100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素，無血清）浸泡備用，所制羊膜均于取材后12 h內使用。②羊膜去上皮：含0.25%胰蛋白酶和0.01%EDTA的消化液37℃消化40 min，用細胞刮刀輕輕刮除上皮細胞，PBS清洗2次，相差顯微鏡下確認上皮細胞全部清除。上皮面朝上鋪于蓋玻片（22 mm×22 mm）上置于6孔培養板內。
1.2.2 兔角膜緣干細胞的原代培養（組織塊法培養）：空氣栓塞處死白兔，無菌條件下摘除眼球，去除角膜緣周圍的附屬組織，用含抗生素的PBS清洗3次，切取角膜緣組織，剪成1 mm3組織塊。用含0.25%胰蛋白酶和0.01%EDTA的消化液消化15～20 min)，500 r/min離心后，棄去消化液，PBS清洗2次，將組織塊置于羊膜上，每孔3塊，間距0.5 cm，無菌靜置10 min。含100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素和20%胎牛血清的DMEM/F12培養液，37℃、5%CO2培養，3 d換液，之后每2 d換液1次，形成單層細胞膜片后用于鑒定或傳代。
1.2.3 角膜緣干細胞的傳代純化：相差顯微鏡下觀察，待組織塊生出的細胞形成單層膜片后，一般為8 d左右，將組織塊取出置于另一羊膜上繼續培養。PBS洗滌2次，0.25%胰蛋白酶37℃消化2～3 min，含血清細胞培養液中止消化，輕輕吹打下的細胞收集入離心管，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入細胞培養液制成細胞懸液，調整濃度至1×105copies/ml，接種于羊膜上，隔日換液，每2 d換液1次。如此傳代3次，去除纖維細胞。待細胞基本長滿后用于鑒定和移植。
1.2.4 角膜緣干細胞的鑒定［1］：免疫熒光鑒定：吸盡培養液，加入1 ml固定液，固定10 min。去固定液，用洗滌液洗3次，每次3～5 min，吸盡液體。用封閉液封閉60 min，在搖床上輕輕搖動。去封閉液，用稀釋的一抗作用60 min，可以在搖床上輕輕搖動。4℃作用過夜。去除一抗，用洗滌液洗滌3～5次，每次3～5 min。去除洗滌液，加入1 ml稀釋好的熒光標記的二抗作用60 min，可以在搖床上輕輕搖動。回收熒光標記的二抗，用洗滌液洗滌3～5次，每次3～5 min。滴一滴抗熒光淬滅封片液于載玻片上，蓋上貼有細胞的蓋玻片，盡量避免氣泡。使細胞接觸封片液，在熒光顯微鏡下觀察熒光。
1.3 統計學方法 本實驗數據均使用SPSS14.0統計軟件進行分析，傳代細胞與原代細胞AE5和p63抗體染色陽性比例間比較采用χ2檢驗，P﹤0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 角膜緣干細胞原代培養與鑒定 相差顯微鏡下觀察，在羊膜上培養24 h，兔角膜緣組織塊邊緣可見有細胞爬出（圖1），大多為圓形、透明狀。之后形成“沙灘樣”移形帶，培養至7～8 d細胞形成單層膜狀（圖2），細胞透明，邊緣整齊，形態呈多樣化，以卵圓形和多邊形為主。若繼續培養至14 d左右，細胞成復層生長。
2.2 采用免疫熒光法鑒定原代培養的干細胞 AE5抗體染色陽性細胞質呈紅色，陰性則不著色（圖3）；p63抗體染色陽性細胞核呈綠色（圖4）。羊膜上培養7 d的細胞AE5抗體陽性細胞比例為（41.72±11.35）%，p63抗體染色陽性細胞比例為（21.57±6.36）%。具體見表1。
2.3 傳代純化的角膜緣干細胞鑒定 經傳代培養，與組織塊原代培養時相比，相差顯微鏡下觀察細胞形態較規整，成纖維狀細胞明顯減少（圖5）。經免疫熒光鑒定，2代AE5和p63陽性細胞比例與原代比較，無顯著性差異（P﹥0.05）；3代AE5和p63陽性細胞比例與原代比較，差異有統計學意義（P﹤0.05），AE5陽性細胞數明顯減少（圖6），p63陽性細胞數增多（圖7）；但4代AE5陽性細胞比例又明顯升高。見表1。 表1 原代與傳代角膜緣干細胞免疫熒光染色結果比較
3 討論
組織工程化角膜是解決角膜移植供體來源最有前途的一個方法。載體是構建組織工程化角膜上皮的關鍵環節，合適的載體應可以促進體外角膜緣干細胞的生長，同時又便于培養的細胞移植。羊膜為胎盤最內層的半透明組織，研究表明，其作為角膜緣干細胞體外培養的載體并用于移植有許多優點：①能為正常角膜上皮生長、移行創造良好的條件。羊膜是人體中最厚的基底膜，含有高濃度的堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、肝細胞生長因子(HGF)和糖蛋白，有利于上皮細胞的分化、移行，并能加強基底上皮細胞的附著和防止上皮細胞凋亡。②免疫原性弱。羊膜不含HLAA、B、C及DR等抗原成分，移植后不被宿主排斥，且在體內可降解［2］。③移植后可以阻止結膜化的發生。羊膜可誘導轉化生長因子（TGF）β等細胞因子在創傷愈合中與成纖維細胞活動有關的信號下調，從而達到抗纖維化效果，減輕瘢痕形成。其中，TGFβ3還是干細胞生長的重要因子。④具有抗微生物特性，因此可降低移植術后感染的發生率。⑤羊膜還具有活躍的物質轉運功能，能允許一些小分子物質如尿素、葡萄糖等通過。⑥羊膜來源廣泛，制備成本低。以上特點使羊膜被認為是工程化角膜上皮的最佳載體［3］。本課題組采用去除上皮細胞的新鮮羊膜作為載體培養角膜緣干細胞，與其他文獻報道相比，細胞生長速度較快，24 h即可見有細胞長出，7～8 d匯合成單層膜狀。這可能與所用羊膜均為取材后12 h內，與干細胞生長相關細胞因子含量豐富有關。
目前對角膜緣干細胞標志物的研究已取得了一定的進展，但仍然缺乏具有特異性的標志物。Schermer等［4］的研究表明，K3蛋白是角膜上皮終末分化的標志性角蛋白，未表達K3是角膜緣干細胞的標志之一。Pellegrini等［5］證實角膜緣基底細胞抗p63抗體陽性，其他部位均陰性；能形成全克隆的細胞是干細胞，而全克隆細胞p63抗體陽性，故認為p63是角膜上皮干細胞的特異標志之一［6］。所以我們采用AE5抗體（K3抗體）和p63抗體行免疫熒光鑒定所培養細胞。本實驗原代培養7 d羊膜上的細胞膜片中AE5陰性細胞較多，說明角膜緣組織塊原代培養可獲得維持于低分化狀態的干細胞；而p63陽性細胞較多則說明細胞增殖能力很強。以新鮮羊膜為載體采用組織塊法培養角膜緣組織可得到含角膜緣干細胞的細胞膜片。3代AE5陰性細胞和p63陽性細胞比例明顯高于原代。
但是實驗過程中發現，角膜緣組織原代細胞中混雜有成纖維狀細胞和其他分化成熟的細胞，且增殖速度高于角膜緣干細胞，培養超過2周則載體全被成纖維狀細胞覆蓋。因不同細胞貼壁程度不同，因此我們利用不同的消化時間將培養細胞傳代克隆化，盡量去除成纖維狀和其他雜細胞。結果表明，夾雜于干細胞間的成纖維狀細胞明顯減少。而且在本實驗條件下，原代細胞濃度為1×105copies/ml傳代，3代AE5陰性細胞和p63陽性細胞比例最多，角膜緣干細胞純度最高。但傳代超過4代，角膜緣干細胞大部分同時表達AE5和p63，說明干細胞已經出現分化。
參考文獻
［1］ 韓曉潔，龔嵐，余振鈺，等.人角膜緣干細胞的體外原代培養和生物學鑒定［J］.解剖科學進展，2005，11(1)：13. ［2］ Schwab IR.Cultured corneal epithelia for ocular surface disease［J］.Trans Am Ophthalmol Soc， 1999， 9(7): 891986.
［3］ 夏涼，趙敏.角膜緣干細胞培養的載體研究概況及進展［J］.中國實用眼科雜志，2005，23(12):12651268.
［4］ Schermer A， Galvin S， Sun TT．Differentiationrelated expression of a major 64K corneal keratin in vivo and in culture suggests limbal location of corneal epithelial stem cells［J］．J Cell Biol， 1986， 103(1): 4962.
組織工程一詞最早是由美國國家科學基金委員會于1987年正式提出和確定的，其基本方法是將體外培養的高濃度的功能相關的活細胞種植于天然的或人工合成的、具有良好生物相容性和生物降解性的細胞外基質材料上，經過一段時間的培養，將這種細胞生物材料復合體植入機體病損部位以形成新的具有其原來特殊功能和形態的相應組織和器官，達到修復創傷和重建功能的目的。
組織工程的技術關鍵是建立由細胞和生物材料構成的三維空間復合體。這一三維空間為細胞的停泊、生長、繁衍、新陳代謝、新組織形成提供支持。作為組織工程細胞支架的生物材料應具備以下特性：良好的細胞親和性；一定的孔徑和互相溝通的三維孔結構；一定的幾何形狀；生物降解性，并最終被機體代謝或吸收。且支架的降解產物不對細胞繁殖產生不利的影響，其降解速度與細胞的增殖速度相匹配；一定的柔韌性，使之既能同機體組織縫合并貼合，又不會對機體組織造成機械損傷等。
近來，絲素蛋白這種天然高分子纖維蛋白已廣泛用于組織工程的研究。Altman等認為絲素蛋白具有如下優點：(1)與其他天然纖維和許多高性能合成纖維相比，有獨特的力學性能；(2)在外科領域的應用已有很長歷史；(3)可以通過不同處理方法獲得膜或其他形態，而且工藝相對簡單；(4)可以通過某些氨基酸的氨基和側鏈的化學修飾較容易地改變表面性能；(5)在體內外可以緩慢降解；(6)對生物體無危險性。
本文綜述了近年來國內外有關種子細胞在絲紊蛋白細胞培養支架方面的研究進展以及應用前景。
1 絲素蛋白在組織工程細胞培養支架方面的研究
1.1 軟骨細胞 關節軟骨損傷后其自身修復能力有限。近幾年絲素蛋白應用于組織工程，為關節軟骨的修復開拓了一個新的領域。日本京都大學和東邦大學(《國外紡織技術》2002年第6期)使用絲素蛋白培養兔軟骨細胞獲得成功。實驗把絲素蛋白溶解在水里。加工成海綿狀，其小孔直徑約為80μm，然后把軟骨細胞“種植”在上面，在37℃的溫度下進行培養，2周后海綿狀絲素蛋白的表面便再生出軟骨組織。上海醫科大學吳海濤等在2000年首次采用蠶絲與軟骨細胞進行復合培養，探索了蠶絲作為軟骨細胞體外培養支架的可行性，他們將胰蛋白酶消化后的蠶絲任意纏繞成網狀，用聚乳酸活鼠尾膠進行包埋，制成三維支架，觀察軟骨細胞生長情況，發現蠶絲對軟骨細胞具有良好的吸附作用，并能維持軟骨細胞正常形態和功能，是適合軟骨細胞立體培養的良好天然支架。
1.2 骨細胞 骨缺損的修復一直是骨組織工程中不斷深人研究的重要和熱門課題。治療骨缺損最理想的植骨材料就是自體骨，然而，自體骨移植存在骨源有限、取材不便，取骨處受到削弱，增大感染概率.增加患者痛苦，不適宜于老年人和少年兒童等諸多問題。因此，尋找一種自體骨的替代材料成為骨組織工程的當務之急。Fini等應用絲素蛋白水凝膠促進兔松質骨缺損動物模型的組織修復，結果發現12周后絲素蛋白水凝膠促進松質骨缺損的修復且沒有明顯的炎癥反應。以上研究表明，絲素蛋白水凝膠應用于承重骨骼的修復(如股骨、脛骨)具有廣闊的前景。
Kaplan等在把絲素蛋白支架材料用于骨組織工程方面作了很多研究。他們采用靜電紡的方法制得絲素蛋白纖維支架材料，在材料上復合BMP-2(骨形成蛋白)或HA(羥基磷灰石)顆粒，通過體外培養的方式觀察骨的形成。研究表明，BMP-2在絲素蛋白纖維材料上上具有生物活性，復合了BMP-2的絲素蛋白支架材料能支持鈣的沉積；絲素蛋白材料能支持hMSCs(人類骨髓間葉干細胞)的生長和分化，有利于骨形成；復合了HA的絲蛋白支架材料能夠促進骨形成；復合了BMP-2和HA的支架材料能在很大程度上提高鈣的沉積和改善BMP－2的轉錄水平。這種加入促進骨組織生長因子的支架材料是非常有潛力的骨組織工程材料，在支架材料中加入組織生長因子來促進組織形成的方法也是今后組織工程支架材料的發展方向。此后，Kaplan等把復合了hMSCs的絲素蛋白支架材料用于體內和體外培養，事實證明經過體外培養的hMSCs／絲素蛋白復合支架材料具有良好的成骨能力，能夠治愈臨界尺寸的骨缺損。
1.3 骨髓間充質干細胞 骨髓具有造血及成骨作用，分為造血和基質兩個系統。骨髓基質系統是指骨髓腔內為造血系統提供結構及功能支持的結締組織，含有少量的多能基質干細胞，研究表明骨髓基質干細胞具有多向分化潛能，在特定的條件下可以形成多種間充質細胞，包括成骨細胞、成纖維細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、肌肉細胞及內皮細胞等。
Altman等將絲素蛋白纖維經特定的理化處理，在保證其抗拉強度下改善絲素蛋白纖維的彈性。形成接近于正常的前十字韌帶結構的絲素蛋白基質材料，研究發現處理加工后的絲素蛋白三維支架同樣支持間充質干細胞的黏附、增殖和分化，與間充質干細胞共培養2周時檢測到韌帶形成相關蛋白(Ⅲ型膠原、I型膠原、黏蛋白c)的轉錄水平明顯增強，而成骨、成軟骨相關基因未見明顯改變，表明絲素蛋白支架促進了間充質干細胞向肌腱細胞的分化，且3周內未見絲素蛋白支架有明顯的機械強度改變。Gregory等用經脫膠的家蠶絲素纖維制作人工十字韌帶。將人類骨髓基質細胞(BM―SC)種植于支架材料上進行培養、擴增。掃描電鏡、DNA定量測試和膠原含量測試等研究結果顯示，此支架能支持人類干細胞向韌帶系統的轉化，同時此絲素蛋白支架也具有良好的力學性能和緩慢的降解性，有望打破前十字韌帶臨床治療的局限性。
MeineI等和Kim等通過體內外一系列實驗研究了間充質干細胞結合三維的絲素蛋白支架修復骨缺損。當培養基中加入含有骨形態發生蛋白2的成骨誘導培養基誘導后，反轉錄一聚合酶鏈反應檢測到成骨相關基因的表達、免疫組織化學觀察到鈣沉積，同時發現接種于絲素蛋白支架上的間充質干細胞向成骨細胞分化明顯提高。5周以后發現骨小梁的形成，隨后將組織工程骨移植入骨缺損部位，同時移植接種間充質干細胞的絲素蛋白支架組、單一的絲素蛋白支架組和無移植物的空白對照組作為對照，移植5周后，工程骨和接種間充質干細胞的絲素蛋白支架組與周邊組織良好融合，骨鈣蛋白、骨橋蛋白染色呈陽性，工程骨組骨形成明顯高于接種間充質干細胞的絲素蛋白支架組，骨小梁開始融合形成骨組織，類似于生理條件下的膜內成骨。
1.4 其他種子細胞在絲素蛋白細胞培養支架方面應用種子細胞在支架材料上黏附、代謝和增殖是組織工程研究的首要環節。Unger等報道了微孔的絲素蛋白無紡網材料能夠支持人上皮細胞、內皮細胞、膠質細胞、角質化細胞、成骨細胞、成纖維細胞等的黏附、增殖、細胞間的相互作用等。同時他們還發現如果預涂上纖維連接蛋白，則觀察到血管化作用中的內皮化現象。楊新林等探討了人血管內皮細胞(HUVEC)在等離子體處理后的絲素蛋白膜表面的生長情況。結果發現SO2和NH3等離子體處理后，絲素蛋白膜表面分別被磺酸化和氨基化，并均能促進HUVEC細胞生長，而且對細胞形態和產生凝血因子的功能沒有明顯的影響，認為絲素蛋白是內皮細胞很好的培養基質。
此外，絲素蛋白支架在肝細胞組織工程中的應用也日益深入。KToyo take探討了人體肝細胞在絲素膜上的體外培養。在絲素膜上播種肝細胞24 h后，觀察到細胞沿基質表面和內部的網狀結構作多重結構的附著。谷一草轉氨酶(GOT)和谷一丙轉氨酶(GPT)化驗結果顯示，接種1～7d，絲素膜上附著的肝細胞的COT和GPT活性值幾乎沒有降低，絲素膜上培養的肝細胞的氨處理能力和肝細胞白蛋白分泌能力也不低于目前最好的肝細胞培養基――膠原蛋白。另外，國內外諸多人士將人體平滑肌細胞、海馬神經元、嗅鞘細胞、雪旺細胞、人類涎腺細胞植于化學修飾及改性的絲素蛋白材料，觀察到絲素蛋白膜上生長的細胞貼壁良好，生長狀況較好，證明了絲素蛋白材料具有良好的生物相容性。
2 前景展望
1. 下列有關基因及基因工程的敘述，正確的是（ ）
①基因是有遺傳效應的DN段，全部位于染色體上
②檢測到受體細胞含有目的基因就標志基因工程操作成功
③為培育抗除草劑的作物新品種，導入抗除草劑基因時只能以受精卵為受體
④每一個基因都包含特定的堿基序列，具有特異性
⑤人體內的肝臟細胞和成熟紅細胞所含的基因相同
A. ①②③ B. ③⑤ C. ②④ D. ④
2. 圖①表示限制酶切割某生物DNA分子的過程；圖②表示該生物體細胞部分基因和染色體的關系；該生物的黑色素產生需要如圖③所示的3類基因參與控制，三類基因的控制均表現為完全顯性。下列說法正確的是（ ）
A. 圖①所示限制酶能識別的堿基序列是TTAA，切點在G和A之間
B. 用限制性內切酶可以從圖②所示基因型的細胞中提取合成黑色素的所有目的基因
C. 圖②所示的生物體中肯定存在含有2個a基因的細胞
D. 若圖③中的1個b基因突變為B，則該生物體仍然可以合成出物質乙
3. 下列關于哺乳動物胚胎發育和胚胎工程的敘述，正確的是（ ）
A. 卵裂期胚胎中細胞數目和有機物總量在不斷增加
B. 胚胎分割時需將原腸胚的內細胞團均等分割
C. 胚胎干細胞具有細胞核大、核仁小和蛋白質合成旺盛等特點
D. 胚胎干細胞是一類未分化細胞，可從早期胚胎中分離獲取
4. 下列關于生物工程的敘述中，不正確的是（ ）
A. 利用胚胎移植技術，可以加快優良種畜的繁育
B. 經誘導融合得到的雜種細胞，需經組織培養才能獲得雜種植株
C. 人工合成法獲得的人胰島基因與體內該種基因的堿基排列順序可能不完全相同
D. 利用DNA探針可檢測出苯丙酮尿癥和21三體綜合征
5. 作物脫毒、改善畜產品的品質、抗除草劑作物、可保存的干擾素、檢測有毒物質、性別鑒定依次是下列哪項生物技術的應用（ ）
①基因工程 ②細胞工程 ③蛋白質工程 ④胚胎工程
A. ②①①③②④ B. ①②②③④④
C. ②①②③②④ D. ②①②④③②
6. 下列與動物細胞培養有關的表述中，不正確的是（ ）
A. 用胰蛋白酶處理肝組織可獲得單個肝細胞
B. 培養液通常含有葡萄糖、氨基酸、無機鹽、維生素和動物血清等
C. 動物細胞培養過程中多數細胞的基因型會發生改變
關鍵詞：人才培養模式；細胞工程技術；教學改革
中圖分類號 G642.0 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2014）01-02-152-02
細胞工程是生物制藥工業中的關鍵技術，它是利用動物細胞體外培養和擴增來生產生物產品，或者作為發現和測試新藥的工具[1]。就目前而言，高校細胞工程技術教學中還存在著一定的問題，如教學內容陳舊，不適合生物類企業對職員的知識和技能需求；教學方法還停留在高等教育的初級階段，教學效果不高[2]等。因此，我們必須加快細胞工程技術類型人才培養模式的改革，進行細胞工程技術教學模式和課程的改革與創新，通過有效的教育模式來提高教學質量，讓學生既掌握細胞工程關鍵技術的基本理論和基本方法，又能掌握細胞工程學科技發展中產生的新技術、新方法，提高學生的創新能力。筆者從教學內容與生產、雙語教學、生產學習與實驗技能幾個方面對提高技能型人才培養目標的教學模式進行了探索研究，以期培養學生的學習能力、實踐能力、創新能力，全面提高教學的質量和效率。
1 教學內容與生產整合
細胞工程學課程內容是按照細胞的主要結構及其功能、相關技術講解的，課程包括細胞工程學發展史、細胞工程學概述、細胞培養及生物學特性、細胞融合、干細胞工程學、細胞克隆及克隆動物與轉基因動物技術等；考慮到細胞培養技術在科研中普遍應用，目前細胞工程學實驗課另外開設了免疫組化、熒光細胞染色與細胞分選、流式細胞儀操作技術、圖像處理等課程。
本科學習中，細胞工程學教學中主要以各種細胞培養為主要線索，了解細胞工程技術具有特定的研究方式，使得他們對細胞工程學有一個全面的認識。例如，動物細胞工程技術應用于診斷和治療疾病的單克隆抗體生產，有幾千種單抗用于生化檢測，而單抗用于人體疾病治療是近幾年來生物制藥的一個重要領域，有幾十種單抗藥物正處于臨床試驗中。通過實驗，學生理解單克隆抗體生產制備技術，并掌握原代及傳代細胞培養技術、培養細胞的觀察方法、細胞融合和分選技術等方法和常用設備的使用方法，為以后的生產研究做好準備。又如，動物細胞表達系統表達的蛋白都是胞外分泌的，產物的分離純化過程非常簡單，但是由于細胞大規模培養技術比較復雜，目前仍處于發展完善階段，因而許多重組蛋白仍選用原核表達系統生產。我們針對這個特點，啟發同學設計較好的細胞大規模培養系統，如改裝的灌流式培養方式，培養和啟迪學生的創新思維。
2 普通教學與雙語教學整合
在當前社會高速發展的時代，社會對細胞工程人才提出了更高的要求，尤其是生命科學院校畢業的學生能否跟上時代的步伐，面向世界進行生物學的交流活動，擴大細胞工程技術在世界的影響，這是細胞工程技術發展至關重要的事。
在細胞工程學原版教材的選擇上要力求最基礎的專業知識內容水平。我們選擇的教材是中國海洋大學出版社2011年10月第1版英文教程《CYTOTECHNOLOGY》，該教材的特點是講授的內容比較全面，語法簡單，對專業性的概念、詞匯以及分子水平的知識進行了淺顯的講解，比較適合用于高等院校學生進行細胞工程專業外語的學習，避免學生由于英語基礎差，導致對抽象晦澀的細胞工程學課程雙語學習產生反感情緒，利于完成雙語教學工作。
3 生產學習與實驗技能整合
學生創新能力和實踐能力的缺乏是高等教育教學改革面臨的問題[3]。因此，要帶領學生參與科學研究與生產實驗技能，強化實踐教學環節。細胞工程技術實踐教學中，聯系生物制品企業生產學習很重要，如我們帶領學生到福瑞邦制藥的廠家參觀學習單抗制備，讓學生注意在實驗操作中可能失敗的原因性，出現問題，及時加以糾正，培養學生良好的實踐能力。針對細胞工程學的實驗教學特點，穿插設計探索性和綜合性的實驗內容，并讓學生自己參與到實驗內容的設計，并調動學生的獨立思考能力和創新思維能力，培養實驗技能和創新思維能力。
實驗大綱列出的實驗項目較多，可整合為三大部分：（1）細胞培養綜合實驗。包括培養技術及細胞觀察，細胞培養實驗還可以將兔角膜上皮、基質及內皮細胞種植于生物材料上進行體外培養，觀察培養細胞的生長、排列和細胞的粘附情況等。（2）經典單抗制備綜合實驗。將單抗制備產生過程中的細胞培養、動物免疫、細胞融合，雜交瘤陽性克隆的篩選與克隆化，抗體檢測5個實驗內容整合為1個單抗制備設計性實驗。教學中不為學生準備傳統的實驗講義，只提出實驗的任務、要求、進度及安全注意事項等，重點突出學生自行完成相關資料查閱，自擬設計方案，自己安排時間完成實驗計劃，獲得實驗結果，撰寫實驗報告。這個實驗計劃6個課時，2次課堂實驗，分別以實驗設計、中期實驗討論與交流、實驗結果課件匯報為主要內容。（3）流式細胞儀分選細胞綜合實驗。包括分選淋巴細胞或是干細胞的篩選，要求學生根據生產實踐需要（如奶牛細胞的分選、白細胞計數及分選等）自己選擇課題，自己設計實驗方法以及最后鑒定。這個實驗計劃12個課時，4次課堂實驗，分別以實驗設計、中期實驗討論、實驗結果課件匯報為主要內容。所有實驗的實驗室全天性開放，學生可利用課余時間主動完成各項實驗操作，老師指導，確保學生在30d內獲得全部實驗結果。老師可根據實驗結果反饋及時調整教學進程和教學方法。通過學生的反饋，可以反映學生是否理解和掌握本課程的目標，并加強了教師與學生之間的溝通，提高了教學效果。
參考文獻
[1]胡顯文，肖成祖.細胞工程在生物制藥工業中的地位[J].生物技術通訊，2001，12（2）：117-122.